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楼主: ezhaoheng
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[(微)生物] 研三微生物专业硕士真心求定位,望各位多多帮助,谢谢! [复制链接]

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囧章 Gemini双子座 枫情万种 一帆枫顺   枫华绝代 荣誉版主

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发表于 2011-10-5 15:11:12 |只看该作者
去年在上班 比较闲 所以有时间改文书什么的 今年真的不行了 自己这几门考试就吃不消了

pp嘛。。。显然都是挑好看的暴。。。其实都是假象 假象啊

我这就睡了 你加油继续做克隆吧 可怜的孩子
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发表于 2011-10-5 19:55:56 |只看该作者
看来LZ是有抱负的人,肯定能有个好前途,先祝福了
说句题外话,LZ在实验过程中可以考虑一些新思路的拓展,比如你要引入GFP,其实这个东西可以被生物正交化学技术完美取代,而且能弥补其很多缺点,如果有可能的话可以换个思路不接GFP的,个人浅见

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发表于 2011-10-5 20:52:37 |只看该作者
首先谢谢你的鼓励与祝福。

然后你说的那个生物正交化学技术,我刚才百度+google了一下,发现似乎是个很新的技术,现在有中科院生物物理所的老师在做,并且2010年发表了文章。乍看起来这个技术很好,但是请问这个技术成熟了吗?需要实验室有什么样的条件和基础才可以开展呢?

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发表于 2011-10-5 21:55:50 |只看该作者
我自己没做过这方面的东西,也都是看文献,不过我觉得这个实现起来不难的,至于成不成熟,如果成熟的定义是能不能重现出来,那我觉得是成熟的,如果定义为是不是有很多人在做这个东西,那可能是不成熟的,祝实验顺利了!

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发表于 2011-10-5 22:12:28 |只看该作者
恩,我再找点文献看看,或者问问国内做相关方面的老师。谢谢你的建议!

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发表于 2011-10-14 09:58:51 |只看该作者
哈哈,连接做出来咯~~

这次改变了一点点策略,做了好多好多的重复,涂了好多好多的板子,终于挑到我要的克隆了。下面还要再做两个类似的克隆,都能搞好的话,就能毕业咯~~也许还能发个水文什么的,只是可惜恐怕申请用不上了~

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发表于 2011-10-14 10:00:17 |只看该作者
怎么做出来的?就是vector和insert比例吗
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发表于 2011-10-14 10:43:05 |只看该作者
涂布数量决定了我这次实验的成功,和vector :insert关系不大。下面具体解释:

我的vector(自己改造过的puc118)大小是4.5kb左右,insert DNA是6.7kb左右,以前做过不同的比例,包括1:3, 1:1, 3:1 等等,然后每个比例涂2-3块板子,没有做成功过。

然后这次只做了两个比例,vector:insert=3:1和1:1,然后每个涂了十几块板子。最后发现两种比例效果都差不多,1:1的可能略好点。关键是这次板子涂得多了,最后得到大约50个克隆子。全部通过质粒快速检测判断质粒大小后,大约有一半有正确的大小。由于我做这个连接的出发载体本身也是类似的大小,担心是否有酶切和回收不完全的出发载体残留在连接体系中,所以我将这些大小正确的克隆子按照正常方法提了质粒,然后酶切验证,最后大约有一半的酶切图谱是正确的。今天选了其中3个去测序,估计这周末能有结果。

在我看来,比例不是非常玄乎的东西,我觉得多数情况下1:1的比例就很好。虽然很多公司(包括实验室的一些师兄师姐)说把插入片段多放点,可以减少载体自连。但是我觉得如果插入片段太多,有可能一个vector两端各连上一个insert DNA,导致连接的失败。我觉得还是两者的摩尔数相似,或者插入片段略多一点就好。这个实验的关键其实在于涂布的数量,之前由于连接效率低,每个板子长得很少,最后筛选不出要的东西。即使这次涂多了,50个克隆子最后得到的有效克隆子也不超过10个,而我如果还是像以前一样做的话,恐怕又是挑出十几个克隆子,然后都是假的。

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发表于 2011-10-14 10:48:22 |只看该作者
唉 看来还是不能用来解决我上次那个克隆的问题
我上次连一整管都涂进去了都没几个对的
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发表于 2011-10-14 10:48:57 |只看该作者
我上次每次挑72个 做了不下10次 一个对的都没有
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发表于 2011-10-14 11:09:17 |只看该作者
什么叫一整管都涂进去了?一整管连接产物还是一整管感受态细胞?

我的连接产物是50ul/管,做转化的时候是8ul的连接产物加到100ul的感受态细胞(自己用CaCl2做的)里。混匀后冰浴30min,42℃90s,然后每管加500ul LB培养基, 37℃ 150rpm摇30min。然后800g离心3min收集细胞,去除多余上清液后留大约80-100ul的上清液重悬细胞(这步起到浓缩的作用)。然后全部涂布到加了抗性的平板上。

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发表于 2011-10-14 11:16:46 |只看该作者
对了,看了下你之前对自己实验的描述,想到两个问题。

你确定你把原来11kb的载体都切开了吗?双酶切是同时切的还是分别切的?如果是分别切的,第一次切完有没有切胶回收,把没切开的质粒全部去掉?如果你第一次没去掉的话,可能你第二部会产生很多实质上只有单酶切的载体,特别容易自连的。

另外,你确定你用的载体可以达到15kb的大小吗?之前有没有人做成功过类似的实验?如果载体本身塞不进那么大的东西,那你试再多次也不可能成功的。

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发表于 2011-10-14 11:41:09 |只看该作者
我就是你那么弄的 离心 然后全体涂上 没用

载体肯定切开了 双酶切 长度也是对的 显然割胶了 不割胶那还不长上百个假阳性。。。

我就是觉得和连接效率和载体承受能力有关 所以后来我也不抱啥希望了
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发表于 2011-10-14 12:02:17 |只看该作者
恩,看来是没什么办法了。guessy也不要再纠结啦,呵呵,反正以后不做这行了。

话说,美国(加拿大)的克隆水平也差不多啊,我还以为我现在做不出来的东西在他们眼里是小case呢~

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发表于 2011-10-14 12:04:22 |只看该作者
我不纠结 这种事情没啥好纠结的 科研做不出东西是正常的 做出东西才不正常

克隆这东西你要什么水平啊 用我之前那个实验室的postdoc的话来说 PCR和cloning就是only god knows what he wants
不过很多时候可以避免使用克隆这个恶心人的方法就是了
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