研三微生物专业硕士真心求定位，望各位多多帮助，谢谢！

GuessyUID: 2184792

去年在上班 比较闲 所以有时间改文书什么的 今年真的不行了 自己这几门考试就吃不消了

pp嘛。。。显然都是挑好看的暴。。。其实都是假象 假象啊

我这就睡了 你加油继续做克隆吧 可怜的孩子

ad7023UID: 2332654

看来LZ是有抱负的人，肯定能有个好前途，先祝福了
说句题外话，LZ在实验过程中可以考虑一些新思路的拓展，比如你要引入GFP，其实这个东西可以被生物正交化学技术完美取代，而且能弥补其很多缺点，如果有可能的话可以换个思路不接GFP的，个人浅见

ezhaohengUID: 2361091

首先谢谢你的鼓励与祝福。

然后你说的那个生物正交化学技术，我刚才百度+google了一下，发现似乎是个很新的技术，现在有中科院生物物理所的老师在做，并且2010年发表了文章。乍看起来这个技术很好，但是请问这个技术成熟了吗？需要实验室有什么样的条件和基础才可以开展呢？

ad7023UID: 2332654

我自己没做过这方面的东西，也都是看文献，不过我觉得这个实现起来不难的，至于成不成熟，如果成熟的定义是能不能重现出来，那我觉得是成熟的，如果定义为是不是有很多人在做这个东西，那可能是不成熟的，祝实验顺利了！

ezhaohengUID: 2361091

恩，我再找点文献看看，或者问问国内做相关方面的老师。谢谢你的建议！

ezhaohengUID: 2361091

哈哈，连接做出来咯~~

这次改变了一点点策略，做了好多好多的重复，涂了好多好多的板子，终于挑到我要的克隆了。下面还要再做两个类似的克隆，都能搞好的话，就能毕业咯~~也许还能发个水文什么的，只是可惜恐怕申请用不上了~

GuessyUID: 2184792

怎么做出来的？就是vector和insert比例吗

ezhaohengUID: 2361091

涂布数量决定了我这次实验的成功，和vector ：insert关系不大。下面具体解释：

我的vector（自己改造过的puc118）大小是4.5kb左右，insert DNA是6.7kb左右，以前做过不同的比例，包括1:3， 1:1， 3:1 等等，然后每个比例涂2-3块板子，没有做成功过。

然后这次只做了两个比例，vector：insert=3:1和1:1，然后每个涂了十几块板子。最后发现两种比例效果都差不多，1:1的可能略好点。关键是这次板子涂得多了，最后得到大约50个克隆子。全部通过质粒快速检测判断质粒大小后，大约有一半有正确的大小。由于我做这个连接的出发载体本身也是类似的大小，担心是否有酶切和回收不完全的出发载体残留在连接体系中，所以我将这些大小正确的克隆子按照正常方法提了质粒，然后酶切验证，最后大约有一半的酶切图谱是正确的。今天选了其中3个去测序，估计这周末能有结果。

在我看来，比例不是非常玄乎的东西，我觉得多数情况下1:1的比例就很好。虽然很多公司（包括实验室的一些师兄师姐）说把插入片段多放点，可以减少载体自连。但是我觉得如果插入片段太多，有可能一个vector两端各连上一个insert DNA，导致连接的失败。我觉得还是两者的摩尔数相似，或者插入片段略多一点就好。这个实验的关键其实在于涂布的数量，之前由于连接效率低，每个板子长得很少，最后筛选不出要的东西。即使这次涂多了，50个克隆子最后得到的有效克隆子也不超过10个，而我如果还是像以前一样做的话，恐怕又是挑出十几个克隆子，然后都是假的。

GuessyUID: 2184792

唉 看来还是不能用来解决我上次那个克隆的问题
我上次连一整管都涂进去了都没几个对的

GuessyUID: 2184792

我上次每次挑72个 做了不下10次 一个对的都没有

ezhaohengUID: 2361091

什么叫一整管都涂进去了？一整管连接产物还是一整管感受态细胞？

我的连接产物是50ul/管，做转化的时候是8ul的连接产物加到100ul的感受态细胞（自己用CaCl2做的）里。混匀后冰浴30min，42℃90s，然后每管加500ul LB培养基， 37℃ 150rpm摇30min。然后800g离心3min收集细胞，去除多余上清液后留大约80-100ul的上清液重悬细胞（这步起到浓缩的作用）。然后全部涂布到加了抗性的平板上。

ezhaohengUID: 2361091

对了，看了下你之前对自己实验的描述，想到两个问题。

你确定你把原来11kb的载体都切开了吗？双酶切是同时切的还是分别切的？如果是分别切的，第一次切完有没有切胶回收，把没切开的质粒全部去掉？如果你第一次没去掉的话，可能你第二部会产生很多实质上只有单酶切的载体，特别容易自连的。

另外，你确定你用的载体可以达到15kb的大小吗?之前有没有人做成功过类似的实验？如果载体本身塞不进那么大的东西，那你试再多次也不可能成功的。

GuessyUID: 2184792

我就是你那么弄的 离心 然后全体涂上 没用

载体肯定切开了 双酶切 长度也是对的 显然割胶了 不割胶那还不长上百个假阳性。。。

我就是觉得和连接效率和载体承受能力有关 所以后来我也不抱啥希望了

ezhaohengUID: 2361091

恩，看来是没什么办法了。guessy也不要再纠结啦，呵呵，反正以后不做这行了。

话说，美国（加拿大）的克隆水平也差不多啊，我还以为我现在做不出来的东西在他们眼里是小case呢~

GuessyUID: 2184792

我不纠结 这种事情没啥好纠结的 科研做不出东西是正常的 做出东西才不正常

克隆这东西你要什么水平啊 用我之前那个实验室的postdoc的话来说 PCR和cloning就是only god knows what he wants
不过很多时候可以避免使用克隆这个恶心人的方法就是了