研三微生物专业硕士真心求定位，望各位多多帮助，谢谢！

ezhaohengUID: 2361091

15# lian_zhuxi

好像Austin没有哪个教授是做这个的。。。

University of Carlifonia- Riverside倒是有几个

ezhaohengUID: 2361091

15# lian_zhuxi

版主在austin吧？Harshey, Rasika （Professor in Molecular Genetics & Microbiology）听说过没有？我刚看了她的页面，做的好像挺有趣的,我指鞭毛那个项目~

lian_zhuxiUID: 2151209

15# lian_zhuxi

版主在austin吧？Harshey, Rasika （Professor in Molecular Genetics & Microbiology）听说过没有？我刚看了她的页面，做的好像挺有趣的,我指鞭毛那个项目~
ezhaoheng 发表于 2011-10-3 02:31

知道这个人 不过不了解她的research

ezhaohengUID: 2361091

呵呵，对她有点兴趣，准备今天套磁。唯一有点担心就是她好像是印度人。。。

lian_zhuxiUID: 2151209

呵呵，对她有点兴趣，准备今天套磁。唯一有点担心就是她好像是印度人。。。
ezhaoheng 发表于 2011-10-3 15:50

好像没听说过她的什么变态事迹  要不我再向同学打听打听

ezhaohengUID: 2361091

谢谢版主，还是等我先套上再说吧，免得你辛辛苦苦问到了，人家不要我，你的努力就白费啦~~

ezhaohengUID: 2361091

20# lian_zhuxi


对了版主，还有一个稍微偏专业方向的问题。。。刚仔细看了下你以前发的帖子（多线作战那个），你提到了转化做不出来的事情。去年的帖子，估计你现在应该也在连接转化方面有些心得了，所以想想你请教一下。我做的课题需要把一个1kb左右的GFP基因，以及一个6.7kb左右的基因簇连接进载体，载体我选的是takara公司的puc118（3.1kb），连接的时候因为酶切位点的问题，只有先连1kb的那段，然后用新的载体（puc118+GFP，约4kb）再去连6.7kb的基因簇，效率很低，每次一块板上只能长4,5个菌落，并且挑出来全是载体自连。感受态肯定没有问题，因为我每次都同时用连接试剂盒里的阳性对照做连接转化，都能长满满一平板。所以现在我初步估计是连接效率低，不知道版主有没有什么解决的办法。

对了补充一下，我现在用的是takara的长片段连接试剂盒，已经是我们这里能买到的比较好的试剂盒了，它里面给的control是puc118连15kb的片段呢。。。

GuessyUID: 2184792

几个事情可以试试
1. 确定你的基因切开了么？
如果不确定 可以先把那个基因连到其他载体上 然后再切那个载体 这样得到的基因就是确定切开了的
2. 用那个叫啥来着的酶处理你的载体 让丫不能自连
好像是叫CIAP还是CIP的那个 去掉末端的那个磷酸基团
3. 测试不同链接环境 比如室温过夜/37度2小时， buffer里各种成分的浓度做个梯度啥的
4. 你用的感受态是啥细胞？有的细胞不太能接受太大的DNA 不过如果你用的是DH5a或者是类似的应该问题不大 不过你还是可以确认一下你这个细胞以前有没有人拿它做过这么大的片段 最起码看看说明书上说这个细胞最多能转化多大的片段

我曾经做一个11kb的载体连3.4kb的基因 到最后那个学期结束了也没连出来。。。然后我就离开那个实验室了 lol

ezhaohengUID: 2361091

23# Guessy

肯定都切开了，因为两个基因我已经都单独转到载体puc118里面了，现在是要把他们连到同一个载体里面去。
我做的是双酶切，自连现象已经很少了。按照正常的情况，应该是自连细胞长满一平板的。可是在我这里，自连的细胞也只有4,5个/平板。
我用的是DH5α，容量方面没有问题。连接试剂盒里面3kb载体+15kb插入片段都能转化的进去。
至于你说的换温度换buffer之类的，我估计效果不大。因为温度和buffer都是试剂盒里面规定的，应该是优化之后的protocol。目前我唯一能调整的也就是insert DNA和vector的比例了，然后多做重复，希望能出现个把个成功的细胞吧。。。

GuessyUID: 2184792

恩 对 调整insert和vector的比例我忘说了
gene cloning这东西就是不靠谱 能不能做出来是上帝决定的。。。
我当时做那个大质粒的时候就是这样 我觉得我连了起码有20次 每次都至少挑36到72个 也是双酶切 CIAP处理不处理我都试过 buffer温度我也都试过 insert和vector比例我也试过 但到最后还是没做出来

另外我不知道你现在什么温度 我做过一些cloning就是换温度之后连出来的
37度连不上的 有时候16度过夜就能连上 如果你实在没办法了可以考虑试试

GuessyUID: 2184792

恩 我那个时候也是每块板子长4-5个

我现在看你觉得就像看到了当时的自己。。。lol

ezhaohengUID: 2361091

26# Guessy

呵呵，大家都是苦命的人啊。。。
我用的是16℃，连接9小时左右。我曾经成功转化过一次（类似大小的另一个片段），当时挑到十几个菌落，其中有一个是成功的，兴奋了我好几天。现在需要转化另一个，看来又要折磨一段时间了。我倒不怕多做几次，就是担心快来不及毕业了。。。
刚老板跟我谈了半天，跟我说质粒如果不好做的话，试试通过同源重组的方法弄到染色体上。概念听起来不错，可是我从来没做过啊，最近都在忙着套磁选校，还有写PS.一想到要重新学一个技术就头疼。。。

GuessyUID: 2184792

16C 9小时应该是比较合适的唉
看来我当年那个15kb的没连出来没啥可抱怨的啊 呵呵
你这个做不出来不会影响毕业啥的吧

ezhaohengUID: 2361091

28# Guessy

会啊，当然会。我的课题就是构建一个菌株，然后看其是否可以提高植物对重金属的耐性。如果菌株构建不出来，后面的就完全没法做了。
今天老板都跟我说了，如果年底还没做好，赶紧换课题，明年再用三个月做个不这么risky的，然后好顺利毕业。。。

对了，guessy姐哪个学校的？

GuessyUID: 2184792

啊。。。这么可怜啊 把毕业时间押在cloning上是最惨的了。。。

我以前是浙大的 现在是ubc的 不过我再也不做research了 yay~