好吧 我承认我很弱 问个gene clone的问题

GuessyUID: 2184792

整个目标是把2个3.4kb的片段连在一个8kb的载体上
现在第一个已经连上去 是双酶切的
第二个怎么也连不上去了
这个是单酶切 为了避免过多污染 我直接PCR产物酶切 酶切位点旁边留了4个碱基给酶bind
虽然PCR的模板是质粒 但我做了割胶回收
现在insert自连很多 和正常的连接差不多 很奇怪为什么自连了还能有抗性呢
还有就是现在这个载体太大了 怎么才能提高连接效率呢

lingli_xiaoaiUID: 172506

subclone有时候就是这样的，我以前做某些vector就是怎么都连不上，很trick,不过我用的blunt ending..这种理论上来说更难连。你连接条件用的是什么。连接的时候少用insert,多用vector能不能改变自联的状况。或者有没有别的酶切为点。。

我有段时间连lentivirual vector,怎么连怎么错误，而且细菌照样有抗性，size出来以后既不是insert又不是vector...我才吐血。不过后来我把每一步都推倒重做，最后用的stbl3而不是dh5a莫名其妙就好了。虽然这种说法不是很科学，我觉得subclone有时候不work没什么原因，就是不work.

另外你的vector是什么性质的？如果是lentivirus vector 按照你那种size出问题很常见，经常自己recommbination了。载体大小跟连接估计影响不大，关键就是弄到细胞里面以后表达成问题。

hill_200341021UID: 2128715

单酶切自连很正常啊，用CIAP处理下。PCR片段直接酶切效率很低，目前这种情况想要连上人品要相当好。

GuessyUID: 2184792

单酶切自连很正常啊，用CIAP处理下。PCR片段直接酶切效率很低，目前这种情况想要连上人品要相当好。
hill_200341021 发表于 2009-6-24 20:01

唉 旧帖被翻出来了 郁闷了
我显然用CIAP处理过呀 不至于傻到单酶切还不CIAP
问题郁闷在vector太长insert也不小 根本连不到一起去
更雷人的是这玩意经过我的千锤百炼有一次居然连上了
后来经过一些列的WB印证丫上面那promoter不够强 要切下来换一个更强的上去
又因为一系列酶切位点的原因 必须要先把promoter换了然后重新连那个最后的insert 上次就白做了。。。
结果现在我面临的情况是原来那个vector更长了 insert更连不上了 又徘徊到这里了

芷瞻UID: 2406956

你可以在已经构建好的那个promoter不够强的载体上将原promoter切除，替换一个强启动子就是了。当然，要考虑你原promoter上下游是否有合适的酶切位点，分步双切，最好将双切后的载体和包含新的强启动子的片段处理为一个粘性末端＋一个平端，这样容易连上，转化后挑克隆，做个PCR和酶切鉴定，希望你实验顺利。